Simvastatin이 메추리 근육 세포에 미치는 영향

QM7세포(Quail muscle cell; American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA)는 10% fetal bovine serum(FBS; Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), 1% chicken serum(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), 1% antibiotic-antimycotic(Invitrogen)를 포함한 Medium199(Sigma- Aldrich) 배양액을 이용해, 37°C, 5% CO₂ 조건에서 배양되었다. Simvastatin은 Sigma-Aldrich에서 구매하였으며, 제조사에서 제시한 방법에 따라 냉장고에 보관하여 실험을 수행하였다. QM7세포는 다양한 농도의 Simvastatin으로 처리가 되었으며, Simvastatin 처리가 수행되는 동안 배지의 조성은 기존의 성장 배지로 유지가 되었다.

QM7세포는 세포의 괴사(Necrosis)와 사멸(Apoptosis)을 확인하기 위하여 Annexin-V / Pi staining을 수행하였다. QM7세포는 PBS로 세척하였으며, 1 × Annexin binding buffer를 처리하였다. 이 후, 5 μL의 Alexa Fluor 488 Annexin-V(Thermo Fisher Scientific, Wilmington, DE, USA)와 1 μL의 100 mg/mL PI 시약을 첨가하였다. 그 후, 세포들은 실온에서 15분 동안 어두운 곳에서 배양되었으며, 형광현미경(한국 경기도 성남시 한국랩텍)으로 촬영하였다.

QM7세포에서의 RNA 추출은 RNAiso Plus kit(Takara, Japan)을 사용하여 진행되었다. RNA 추출은 6 well 기준 200 uL의 RNAiso Plus reagent를 넣고 PIpetting을 통하여 완전히 풀어준 다음 상온에 5분간 정치시켰다. 그 다음 100 μL의 chloroform을 넣고 15초간 섞어준 후 상온에서 10분간 정치시켰다. 그 다음 4°C에서 15분간 12,000 rpm으로 원심분리하여 상층액을 새 1.5 mL 튜브에 옮기고, 250 μL의 isopropanol을 넣고 여러 번 흔들어 주었다. 그 후 다시 4°C에서 10분간 12,000 rpm으로 원심분리를 실시하여 상층액을 버리고, 75%의 ethanol(DEPC-ethanol)을 500 μL를 넣고 다시 4°C에서 5분간 12,000 rpm으로 원심 분리를 하였다. 마지막 원심분리 후, 상층액을 버리고 pellet을 상온에서 잠시 건조시킨 후, RNase-free water 20 μL를 넣어서 녹이고, NanoDrop ND-1000 Spectrophotometer(Thermo Scientific, Wilmington, DE, USA)를 사용하여 농도와 순도를 확인한 다음–80°C에 보관하였다.

cDNA의 합성은 1^st strand cDNA Synthesis Kit(Takara, Japan)를 사용하였으며 제조사 프로토콜을 따라 합성을 진행하였다. 먼저 RNA를 1 ug 넣은 후 oligo dT primer 1 μL, dNTP 1 μL 그리고 나머지는 DEPC-treated water를 사용하여 전체 10 μL를 만들었다(Mixture 1 − 전체 10 μL). Mixture 1를 65°C에서 5분간 정치 후 ice에 옮겨 두었다. 그 다음 5 × Buffer 4 μL, RNase inhibitor 0.5 μL, RTase 1 μL, 나머지 DEPC-treated water를 넣어주었다(Mixture 2 − 전체 20 μL). 30°C에서 10분간 정치시킨 후, 50°C에서 60분간 처리하여 최종적으로 cDNA를 획득하였다.

PCR 반응액은 각 cDNA 1 μL, primer(F+R) 2 μL, 10 × buffer 2.5 μL, dNTP 2 μL, Taq 0.3 μL 그리고 D.W 17.2 μL로 총 25 μL을 사용하여 진행하였다. PCR 조건은 우선 94°C에서 10분간 변성시키고, 94°C에서 30초, 각각의 annealing 온도에서 30초, 그리고 72°C에서 30초로 이루어진 cycle을 38회 반복하였고, 최종적으로 72°C에서 5분간 신장하여 완료하였다. PCR 결과물들은 1.5% agarose gel을 이용하여, 90V에서 50분간 전기영동을 실시하였으며, UV transilluminator를 통해서 각 샘플들의 유전자 발현차이를 조사하였다.

유전자들의 상대적 발현량을 확인하기 위해서 BioRad CFX-96(BioRad, Hercules, CA, USA)을 사용하여 real-time PCR을 수행하였다. 실험에 사용되었던 primer의 서열은 Table 1에서 보는 바와 같다. PCR 반응물은 각 시료의 cDNA 2 μL, primer(5pmol/μL, F+R) 2 μL, 10 × buffer 2.5 μL, dNTP 1 μL, Taq 0.2 μL, SYBR Green(Bio-Rad, Hercules, CA, USA) 1 μL에 D.W 16.3 μL를 추가하여 총 25 μL를 사용하였다. Real-time PCR 조건은, 우선 94°C에서 10분간 변성시키고, 94°C에서 30초, 각 primer 별 annealing 온도에서 30초, 그리고 72°C에서 30초간의 40 cycle을 반복하고, 마지막으로 65°C에서 95°C까지 5초당 0.5°C씩 총 5분간 melting curve를 확인하였다. 모든 측정은 시료 당 3회 반복하였고, 2^−ΔΔCt 방법[ΔΔCt = 처리구(타켓 유전자의 Ct 값 – GAPDH 유전자의 Ct 값) – 대조구(타켓 유전자의 Ct 값 – GAPDH 유전자의 Ct 값)]을 이용하여 유전자의 상대적 발현량을 계산하였다(Livak, 2001). 유전자의 상대적 발현량을 계산하기 위해 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH)를 참조 유전자로 이용하였다.

근육 세포의 손상 조건을 확립하기 위하여 QM7(Quail Muscle Cell)에 Simvastatin을 처리하였다. 처리의 수준은 기존에 수행되었던 다른 축종의 선행 연구를 참고로 하되(Ogura et al., 2007; Baba et al., 2008; Essid et al., 2019), QM7 세포에서 손상을 줄 수 있는 적정 농도를 측정하기 위하여 다양한 농도(100 nM, 250 nM, 500 nM, 750 nM, 1 uM, 2.5 uM, 5 uM, 7.5 uM, 10 uM)로 Simvastatin을 처리하였다(Fig. 1). 그 결과, Simvastatin의 처리 농도가 증가함에 따라 생존한 전체 QM7 세포의 수는 감소하는 경향을 보였다(Fig. 1A). 그러나 750 nM의 Simvastatin을 기준으로 처리 농도가 증가하였음에도 불구하고 세포의 사멸이 유의적으로 증가하지 않는 것을 확인하였다. 또한 세포의 형태학적인 변화를 살펴보았을 때도, 250 nM의 Simvastatin에서부터 세포의 손상이 일어나는 것을 확인하였으며, 750 nM의 Simvastatin을 처리하였을 때 세포의 손상이 급격히 일어나는 것을 확인할 수 있었다(Fig. 1B). 이를 통하여 750 mM의 Simvastatin이 QM7 세포의 손상을 유도하는데 적합하다고 판단하여, 이후의 실험을 진행하였다. 앞서 소개한 선행 연구들은 용량 의존적 분석은 수행되지 않았으나, 마우스(C2C12) 와 랫(L6) 근육 세포에서 1uM의 Simvastatin의 처리에 따라서 근육의 손상이 일어나는 것을 확인하였다(Ogura et al., 2007; Essid et al., 2019).

Fig. 1. Myotoxicity test in QM7 cells by Simvastatin stimulation. (A) Proliferation analysis of Simvastatin-treated QM7 myoblast cells depending on various dose. (B) Morphology of QM7 cells treated with various concentration of Simvastatin. Scale bar: 100 μm. Data are expressed as mean±SD (n=3). Statistical significance was measured using one-way ANOVA. a, b, c, d, de, f -the result of statistical analysis (one-way ANOVA Duncan test), values followed by the same letter in a Duncan grouping are not significantly different, the subscript number and letter color are corresponding to the chart legend.

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앞선 실험을 통하여 근육 손상의 조건을 확립하기 위하여 다양한 농도의 Simvastatin을 처리하였다(Fig. 1). 그리고 이를 통하여 최종적으로는 750 nM의 Simvastatin이 적절한 농도임을 확인하였다(Fig. 2A). 이 후 실질적으로 Simvastatin의 처리가 세포 사멸과 괴사를 일으키는지 확인하기 위하여 Annexin V와 PI staining을 수행하였다(Fig. 2B). 그 결과, 대조군에 비해서 Simvastatin을 처리한 그룹에서 Annexin V와 PI 모두 2–fold change 이상 발현이 증가한 것을 확인할 수 있었다. 이러한 결과는 Simvastatin 처리가 실질적으로 세포의 사멸과 괴사를 유도하는 것임을 나타낸다. Statin 계열의 약물이 근육의 괴사와 사멸을 유도한다는 것은 이미 많은 다른 연구를 통하여 잘 알려져 있다(Westwood et al., 2005). Simvastatin의 경우에는 대부분 종양세포의 괴사에 대한 연구들이 진행되어 왔으나(Cho et al., 2008; Oliveira et al., 2008), 일부의 연구들은 Simvastatin의 부작용으로 인한 근육의 손상 및 괴사에 대한 연구들도 수행되어 왔다(Levy et al., 1992; PIerno et al., 1995; Evans and Rees, 2002).

Fig. 2. Simvastatin provoked myotoxicity on QM7 myoblast cells. (A) Morphology of QM7 cells after Simvastatin treatment. Scale bar: 100 μm. (B) QM7 cells stained with Annexin V-FITC and PI after Simvastatin treatment.

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Simvastatin 처리를 통한 근육의 손상이 근위축증이라고 하는 근육 내 단백질의 붕괴에 의해서 일어나는지를 확인하기 위하여, Simvastatin을 처리한 QM7 세포를 활용하여 qRT-PCR을 수행하였다(Fig. 3). qRT-PCR은 근위축증 마커 유전자인 Atrogin-1(FBXO32, F-Box Protein 32)과 TRIM63 (MURF1, Tripartite Motif Containing 63)에 대하여 양적 분석을 수행하였다(Fig. 3A). 그 결과, Simvastatin 처리에 따라서 Atrogin-1 유전자의 경우에는 약 3.5배 정도 증가하는 것을 확인하였으며, TRIM63의 경우에는 약 2배의 증가량을 보이며 근위축증 현상이 일어나는 것을 확인하였다. 근육은 인체에 있어 가장 큰 단백질의 저장소이며, 근육 단백질의 손실은 질병이나 노화 등 다양한 원인에 의해 일어나는데, 그 중에서도 근위축증은 근육 단백질의 손상을 일으키는 주요 원인 중 하나이다(Kandarian and Jackman, 2006). 근위축증은 다양한 경로를 통하여 일어나게 되는데, 일반적으로는 Glucocorticoid, Myostatin, Free fatty acids(FFAs), 그리고 Inflammation cytokines를 통하여 근위축증이 유도된다. 일단 Glucocorticoid, Myostatin, Free fatty acids(FFAs), 그리고 Inflammation cytokines를 통하여 근위축증 신호전달 경로가 유도되면 각각 Glucocorticoid 수용체, SMAD2/3, NF-kB를 조절하게 되고 이를 통하여 Atrogin-1, MURF1가 유도되어 근원섬유가 분해되어 근위축증이 일어나게 된다(Wang et al., 2001). 본 연구팀은 QM7 세포에 Simvastatin을 처리하여 Simvastatin이 근육 내 단백질의 붕괴를 일으켜 근육의 손상을 유도한다는 것을 알 수 있었다. 추가적으로 이러한 근위축증이 어떠한 신호전달 경로를 통하여 일어나는 가를 확인하기 위하여 근위축증 신호전달 경로의 상위에 있는 유전자인 SMAD2/3, FOXO1 유전자에 대하여 양적 발현분석을 수행하였다(Fig 3B). 그 결과, Simvastatin 처리에 따라 SMAD2가 7배 이상의 발현량 증가를 보이는 것을 확인하였으며, SMAD3과 FOXO1의 경우에는 약 2배의 발현량 증가를 보이는 것을 확인하였다. SMAD2와 SMAD3의 경우에는 SMAD4와 결합하여 SMAD 복합체를 구성하여 단백질의 합성을 저하시키는 한편, Atrogin-1과 MURF1의 전사를 촉진시켜 단백질의 붕괴를 일으킨다고 알려져 있다(Goodman and Hornberger, 2014). 또한 SMAD는 그 자체로 위성 세포의 분화를 억제시켜 근육의 재생을 억제하는 것으로 알려져 있다(Aloysius et al., 2018; Farhang-Sardroodi and Wilkie, 2020). 이를 통하여 Simvastatin의 처리가 FOXO1의 발현 조절을 통한 근육 세포 내 단백질의 붕괴를 초래하기도 하지만, SMAD 신호절달 경로를 통한 위성 세포의 정지(satellite cell quiescence) 및 근위축증 연관 유전자의 발현을 촉진시켜 근육의 재생을 억제하여 근육의 손상을 초래할 것이라는 잠정적 결론을 얻을 수 있었다. 본 연구는 Simvastatin의 처리를 통한 근육 손상의 메커니즘을 구명하기 위한 연구이며, 차후 각 신호전달체계의 조절에 대한 연구가 더 필요할 것으로 보인다. 이는 향후 근육의 손상 메커니즘을 이해하고, 이들을 유도하는 신호전달 체계를 이해하는데 기초적인 정보를 제공할 수 있을 것으로 사료된다.

Fig. 3. Transcriptional analysis of Atrogin-1, TRIM63 and their upstream signaling genes in QM7 cells after Simvastatin stimulation. (A) The mRNA expression pattern of muscle atrophy marker genes (Atrogin-1, TRIM63), and (B) upstream genes of atrophy signaling cascade (SMAD2, SMAD3, FOXO1). The mRNA expression levels were measured by real-time PCR. mRNA fold-change was normalized to GAPDH mRNA. ^*P<0.05, ^**P<0.01, ^***P<0.001, ^****P<0.0001. by unpaired two-tailed student’s t-test.

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