초위성체 마커를 활용한 가축다양성정보시스템(DAD-IS) 등재 재래닭 집단의 유전적 다양성 분석

본 연구에 이용된 공시재료로는 국립축산과학원 가축유전자원센터에서 중복보존 중인 재래닭 5개 집단(회갈색, 흑색, 적갈색, 백색, 황갈색) 및 연산오계 집단과 제주 및 관리농가 유래 재래닭 4개 집단(현인, 횡성약닭, 황봉, 풍동)에 대조구로 외래 도입 토착종 4품종(아라우카나, 로드아일랜드레드, 화이트레그혼, 코니시) 7개 집단을 추가하여 총 18개 집단 548수를 이용하였으며(Table 1), 익하정맥에서 채혈한 혈액으로부터 Genomic DNA Purification Kit(Promega, Madison, Wisconsin, USA)를 이용하여 DNA를 추출하였다.

집단별 다양성 분석을 위해 사용한 MS marker는 ISAG/ FAO(FAO, 2004)에서 권고하고 있는 MS marker 10종(ADL0278, LEI0094, LEI0166, MCW0016, MCW0037, MCW0078. MCW0111, MCW0206, MCW0295, MCW0330)과 Roslin Bioinfomatics Group에서 제공하는 ArkDB database website를 참고하여 다양성이 높게 보고된 15종(ADL0176, ADL0267, LEI0092, LEI0096, LEI0099, LEI0135, LEI0209, MCW0145, MCW0193, MCW0214, MCW0233, MCW0240, MCW0252, MCW0301, MCW0322)의 마커를 선별하여 총 25종을 이용하였다.

추출된 DNA는 UV Spectrophotometer (NanoDrop NA-1000; Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA)을 이용해 농도를 측정한 후, 최종 10 ng/μL가 되도록 증류수에 희석하여 PCR 증폭을 위한 주형으로 사용하였다. 각 마커별 증폭산물의 크기와 형광표지 등을 고려하여 2∼6개씩 Multiplex 조합을 만든 후, DNA 중합효소, dNTP, KCl, MgCl₂ 등이 포함되어 있는 AccuPower^TM Negative dye PCR PreMix (Bioneer, Daejeon, Korea)를 이용하여 주형 DNA 2 μL, primer는 각각의 multiplex 조합별로 조건에 맞게 0.4 μL∼2.6 μL(2 pmole/μL)을 첨가하고, 최종부피가 20 μL가 되도록 증류수를 첨가한 후, multiplex PCR을 수행하였다. PCR 반응은 GeneAmp PCR system 9700(Applied Biosystems, Foster, California, USA)을 이용하여 수행하였으며, 95℃에서 5분간 pre-denaturation, 95℃에서 60초간 denaturation, 각 조합에 따라 55∼62℃에서 45초간 annealing, 72℃에서 60초간 extension을 35회 반복한 후 72℃에서 30분 동안 final extension을 실시하였다.

증폭된 PCR 산물은 Hi-Di Foramide(Applied Biosystems, USA)와 GeneScan 500Liz Size Standard(Applied Biosystems, USA)를 혼합하여 10분 동안 95℃에서 denaturation 시킨 후 즉시 얼음에 넣어 상태를 유지하게 한 다음 자동 염기 서열 분석 장치인 ABI PRISM 3130XL Genetic Analyzer(Applied Biosystems, USA)에 장착하여 POP 7 polymer(Applied Biosystems, USA)상에서 모세관 전기영동을 통해 분석하였다. 각 마커별 대립유전자들의 크기는 GeneMapper version 5.0 software(Applied Biosystems, USA)를 이용하여 결정하였고, 크기가 결정된 좌위들은 공시된 개체별로 Microsoft Excel 2016(Microsoft, Redmond, Washington, USA)을 이용하여 자료를 취합한 후 각 통계분석 방법에 적용하였다.

크기가 결정된 마커별 대립유전자들은 MS tool Kit(Park, 2000)을 이용하여 마커 및 집단별 관측이형접합도(H_obs), 기대이형접합도(H_exp), 다형정보지수(PIC) 등을 계산하였다. 집단간 유전 거리 추정을 위해서는 DISPAN(Ota, 1993)을 이용하여 Nei 등(1983)의 방법에 따라 DA 유전거리를 산출하였으며, 이를 토대로 PHYLIP program pakage(http://evolution.genetics.washington.edu/phylip.html, Felesenstein, 2010)을 이용하여 Neighbor-Joining phylogenetic tree를 작성하였고, TreeView 1.6(ftp://eeb.lu.lv/pub/GIS/datu_analiize/TreeView/treeview_manual.html, Roderic, 1996)를 이용하여 도식화였다.

집단의 유전적 균일도 추정은 STRUCTURE software (Pritchard et al., 2000)을 이용하였으며, 구분 가능한 집단 수(K값)을 추정하기 위해서 K를 2부터 18까지 설정하였고, 각 값에 대한 평균 추정치 Pr(X│K)와 표준편차를 계산하고, burn-in 20,000회, MCMC(markov chain Monte Carlo)반복수 100,000회, 이를 10회 반복하여 계산된 결과를 Evanno 등(2005)의 방법이 적용된 STRUCTURE HARVESTER (Earl and von-Holdt, 2012)를 사용하여 ΔK 값을 계산하여 최적의 K값을 결정하였으며, CLUMMP(Jakobsson and Rosengerg, 2007)를 이용해 10회 반복하여 나온 최적의 K값에 대한 cluster별 유전적 균일도를 계산하였고, 이후 각 cluster에 대한 집단의 실제 분포를 DISTRUCT(Rosenberg, 2004)를 이용하여 도식화 하였다.

25개 MS마커를 이용하여 11개 재래닭 집단, 7개 외래 도입 토착종 집단을 포함하여 총 18개 집단 548수에 대한 마커별 대립유전자 수(NA), 기대이형접합도(H_exp), 관측이형접합도(H_obs), 다형정보지수(PIC)를 Table 2에 제시하였다. 마커별 대립유전자 수의 경우 3∼14개의 범위로 총 195개의 대립유전자가 나타났으며, 마커별 평균 7.80개의 대립유전자를 보유하고 있는 것으로 확인되었다. H_exp와 PIC의 경우 MCW0145에서 각각 0.646, 0.569, H_obs의 경우 ADL0278에서 0.773으로 가장 높게 나타났으며, 반대로 MCW0078에서 는 H_exp, H_obs, PIC 각각 0.263, 0.291, 0.217로 가장 낮은 수치를 보이고 있었다. 한편, 다형성이 높게 나타난 MCW0145의 경우 우리나라 재래닭 및 외래 도입 토착종 집단을 대상으로 진행한 여러 논문(Kong et al., 2006; Seo et al., 2013; Suh et al., 2014)에서도 높은 다형성을 나타내고 있는 것으로 보고되었으며, 다형성이 낮게 나타난 MCW0078의 경우에도 우리나라 재래닭 집단에서뿐만 아니라, 다른 여러 국가의 닭 집단에서도 낮은 다형성을 나타내고 있는 것으로 보고되었다(Tadano et al., 2007; Ding et al., 2010; Abebe et al., 2015; Long et al., 2017).

Table 3에서는 공시된 18개의 집단별 평균대립유전자수(MNA), 기대이형접합도(H_exp), 관측이형접합도(H_obs), 다형정보지수(PIC)를 제시하였다. 분석 결과, 모든 수치가 황갈색재래종(KNY) 집단(MNA: 4.60, H_exp: 0.627, H_obs: 0.643, PIC: 0.563)에서 가장 높게, 횡성약닭(HYD) 집단(MNA: 1.84, H_exp: 0.297, H_obs: 0.286, PIC: 0.236)에서 가장 낮은 것으로 확인되었다. 특히 횡성약닭(HYD) 집단의 경우, 모든 지표에서 현저하게 낮은 다양성 수치를 나타내었는데, 이는 다른 집단과는 달리 매우 소수의 개체수를 가지고 그 혈통을 유지하고 있기 때문인 것으로 사료된다. 또한 산란계에 속하는 화이트레그혼 두 집단(LGF, LGK)과 아라우카나(ARA) 집단의 경우 다른 집단에 비해 상대적으로 낮은 다양성을 보이고 있는데, 이는 타집단에 비해 산란능력 발현을 위해서 유전적 고정화 작업이 강력하게 이루어졌기 때문인 것으로 사료된다.

공시된 18개 집단 간 유전거리 및 유연관계를 추정하기 위해 마커별 대립유전자의 빈도를 바탕으로 DISPAN(Ota, 1993)을 통해 계산된 집단간 DA 유전거리(Nei et al., 1983)를 Table 4에 제시하였다. 분석 결과, 횡성약닭(HYD)과 화이트레그혼F(LGF) 집단 사이에서 0.675의 가장 먼 유전거리를 나타냈으며, 같은 품종인 로드아일랜드레드 두 집단(RRC, RRD) 사이에서 0.027의 가장 가까운 유전거리를 보였고, 역시 같은 품종인 화이트레그혼 두 집단(LGF, LGK) 사이에서도 0.092의 매우 가까운 유전거리를 보였다. 한편, 코니시 두 집단(COS, COH) 사이에서는 같은 품종임에도 불구하고, 0.313의 비교적 먼 유전거리를 나타내고 있는데, 이는 두 집단이 유전적 차이로 인해 갈색(COS)과 흑색(COH)으로 구분되는 집단이기 때문인 것으로 사료된다. 재래닭 집단간의 유전거리를 살펴보면 횡성약닭(HYD)과 긴꼬리닭(LTC) 집단 사이에서 0.611로 가장 먼, 적갈색재래종(KNR)과 황갈색재래종(KNY) 집단에서 0.187로 가장 가까운 유전거리를 나타내고 있었으며, 동일한 집단을 공시재료로 이용한 Lee et al.(2011), Suh et al.(2014)의 연구 결과에서도 적갈색재래종(KNR)과 황갈색재래종(KNY) 집단 사이에서 굉장히 가까운 유전거리를 형성하고 있는 것으로 보고되었다.

각 집단간 추정된 유전거리를 바탕으로 PHYLIP program package을 이용하여 Neighbor-joining(Saitou and Nei, 1987)의 방법으로 작성한 집단간 Phylogenetic tree를 Fig. 1에 제 시하였다. 전반적으로 화이트레그혼 두 집단(LGF, LGK)이 별도의 가지를 형성하는 것으로 나타났으며, 청란을 낳는다고 보고되어 있는(Wang et al., 2013) 아라우카나 집단(ARA)이 산란계인 화이트레그혼 두 집단과 같은 군집을 형성하고 있는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 코니시 두 집단(COS, COH)는 같은 품종임에도 불구하고, 서로 다른 가지를 형성하고 있는 것을 다시 한 번 확인할 수 있었다. 한편, 흑색재래종(KNB), 현인흑계(HIC), 연산오계(KNO) 집단의 경우 흑색코니시(COH) 집단과 같은 군집을 형성하고 있는 것으로 나타났는데, 이는 4개의 집단 모두 흑색의 모색을 가지고 있기 때문인 것으로 사료되며, 전반적으로 각 집단이 비교적 확연하게 구분되는 것을 확인할 수 있었다.

Fig. 1. Neighbor-Joining Phylogenetic tree showing genetic relationships among 18 chicken populations based on DA distances.

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공시된 18개 집단이 유전적으로 몇 개의 군락으로 구분하는 것이 적절한지를 추론하기 위해 Bayesian clustering법이 적용된 STRUCTURE software를 이용하여 K값을 2부터 18까지 설정한 후, 10회 반복하여 분석한 결과를 바탕으로 STRUCTURE HARVESTER를 이용해 Evanno et al.(2005)의 방법으로 최적의 K값(ΔK)을 계산한 결과 K=15에서 가장 높은 ΔK(66.22)이 나타나는 것을 확인할 수 있었다(Table 5). 최적의 K값으로 나온 15는 본 연구에서 공시된 18개의 집단이 25개의 MS마커에서 나온 대립유전자의 빈도를 바탕으로 구분하였을 때 15개의 집단으로 구분하는 것이 유전적으로 가장 적합하다는 것을 의미한다. Table 6에서는 15개의 군락으로 구분했을 때의 집단별 유전적 균일도를 나타내었으며, Fig. 2에서는 집단별 군락 형태를 DISTRUCT Software(Rosenberg, 2004)를 이용하여 보기 쉽게 도식화한 결과를 제시하였다. 18개의 집단 중 14개의 집단에서 90%이상의 높은 유전적 균일도를 나타내었으며, 황갈색재래종(KNY)과 현인흑계(HIC) 집단에서도 각각 88.9%, 83.9%의 비교적 높은 균일도를 형성하며 독립적인 군락을 형성하고 있었다. 앞서 제시했던 유전거리 분석결과와 마찬가지로 같은 품종인 화이트레그혼 두 집단(LGK, LGF)과 로드아일랜드레드 두 집단(RRC, RRD)는 각각 12번 군락과 4번 군락에서 매우 높은 균일도를 형성하고 있는 것으로 나타났지만, 코니시 두 집단(COS, COH)의 경우 각각 10번 군락과 14번 군락에서 독립적인 집단으로 구분되는 것을 확인할 수 있었다. 한편, 연산오계(KNO) 집단의 경우 8번 군락에서 다소 낮은 76.3%의 균일도를 보이고 있었으나, 본 군락에서 가장 높은 균일도를 형성하고 있는 것으로 보아 독립적인 집단으로 구분하는 것이 타당하다는 결론을 내릴 수 있었으며, 이는 Suh 등(2014)의 연구 결과와 비슷한 것으로 나타났다. 반면, 제주재래닭(JJC) 집단의 경우 독립적인 군락을 형성하지 못하고, 황갈색재래종(KNY) 집단이 속해 있는 2번 군락에서 가장 높은 44.3%의 균일도를 보이고 있었으며, 3번 군락(17.7%)과 8번 군락(19.1%)에도 일부 포함되어 있는 것으로 나타났다. 이를 통해 제주 재래닭 집단은 낮은 균일도로 인해 독립적인 집단으로 구분하는 것이 어려울 것으로 판단되며, 이는 사육 과정 시 일부 개체에서 타 집단과의 교잡이 일어났기 때문인 것으로 보인다. 따라서 추후 본 집단을 독립적인 집단으로 구분하기 위해 철저한 개체 식별 및 계획 교배를 통하여 지속적인 계통 조성 과정이 필요할 것으로 사료된다.

Fig. 2. Clustering assignment of the 18 chicken populations obtained by STRUCTURE analysis (K=15).

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