K-Means Clustering으로 분류한 닭 깃털색 표현형의 분석

본 연구에서는 연산오계(Yeonsan Ogye: YO)와 화이트레그혼(White Leghorn: WL)을 cross-breeding하여 생산된 F₂ generation 집단을 사용하였다. YO는 국내 재래닭 중 유일한 가금 천연기념물로, 피부, 근육 및 골격이 검다는 특징을 가지고 있으며(Lee, 2019) 이와 대조적으로, WL은 전세계적으로 가장 널리 알려진 산란계 품종으로 백색 피모색을 가지고 백색란을 낳는 특징이 있다.

본 연구에 사용된 집단은 부모세대(F₀) 수컷 1수와 암컷 5수로 이루어진 2개의 라인(B라인, L라인)으로 구성되어 있다. F₁ 세대는 F₀의 암컷 5수에 각각 1개의 라인으로 총 5개의 라인으로 구성되어 있고, F₂ 집단을 구성하기 위하여 F₁ 각 라인 별로 수컷 1수와 암컷 10수를 선발하여 전형매 교배를 실시하였다. 최종적으로 생산된 F₂ 세대를 본 분석에 활용하였으며, B라인은 F₀의 수컷이 YO, 암컷이 WL이고, L라인은 F₀의 수컷이 WL이고 암컷이 YO이다. 사용된 F₂는 B라인이 468수, L라인이 415수다. 시험에 관련된 닭의 관리 및 취급은 충남대학교 동물실험윤리위원회(IACUC, No. 202103A-CNU-061) 승인을 얻은 후 본 규정을 준수하여 시행하였다.

표현형을 분류하기 위한 RGB(Red, Green, Blue) 값을 생산하였으며 그 수집하는 과정은 다음과 같다. 집단 내 개체 별 깃털색 표현형을 조사하기 위해서 (1) 날개를 인위적으로 펴게 했을 때와 (2) 날개를 접었을 때, 총 2장의 사진을 촬영하였다. 본 분석에서는 보다 정확한 표현형을 나타내는 날개를 인위적으로 들고 찍은 사진 데이터만을 사용하였다. 모든 사진은 카메라(D80, Nikon, Tokyo, Japan)를 사용하여 배경, 조명, 각도, 개체 방향을 동일하게 세팅한 환경에서 촬영하였다.

각각의 개체는 배경과 개체의 구분을 정확하게 하기 위해 파이썬(Python version 3.8.0; Python Software Foundation, 2019) 환경에서 배경을 제거하였다. 본 연구에서 필요한 깃털색에 해당하는 정보를 추출하기 위해 Adobe Photoshop CC 2021(Adobe, Mountain View, CA, USA)을 이용하여 개체의 머리와 몸통, 다리를 분리하였다. 머리와 몸통, 몸통과 다리 부분 중, 색깔이 확연히 달라지는 지점을 기준으로 이미지를 분리하였으며, 이후 수행되는 분석에서는 몸통 부분에 해당하는 이미지를 사용하였다.

이미지들은 RGB 색상 조건에서 PNG-24비트 형식으로 처리되었다. 개체의 색상 및 패턴을 수치화하기 위해 해당 이미지 픽셀의 R값, G값, B값의 개체별 평균 및 표준편차를 구하였다. 수치화된 값은 라인별 차이를 확인하기 위해 PCA와 k-means clustering에 사용되었다.

닭의 피모색에 해당하는 픽셀들을 모두 모아 RGB 각각에 대해서 k-means clustering을 진행하였다. 그 후 모든 라인의 픽셀 값들 중 반을 무작위 선발하였다. 사용된 집단 내 깃털의 대표 색이 검은색, 하얀색이기 때문에, k는 2로 설정하였으며 k-means clustering은 파이썬 환경에서 scikit-learn 1.0.2에 KMeans 모듈을 사용하였다.

K-means clustering을 할 때, 이미지의 픽셀 수에 R, G, B 개수인 3을 곱해 이미지를 재배열한다. Clustering 이후, centroid 값을 모든 픽셀들에 적용시키면, 이미지는 특정 색상의 수만을 가지게 된다. 본 연구에서는 B와 L라인의 t-test의 결과를 확인하기 위하여 이미지 양자화를 진행하였으며 이미지 양자화한 사진은 Fig. 1에서 제시된 바와 같다.

Fig. 1. The image quantization and pie chart using quantization image. (A) Original image, (B) quantization image, (C) pie chart using quantization image.

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Fig. 2는 한 개체에서 얻어진 B와 L 라인의 평균과 표준편차에 대한 히스토그램 결과이다. Fig. 2에서 확인된 바와 같이 평균은 B와 L 라인 모두 중간값을 나타내는 개체는 빈도가 적으며, RGB 평균값이 낮은 부분과 높은 부분에서 중간값에 비해 상대적으로 높은 빈도를 보이는 것을 확인할 수 있었다. 또한 표준편차는 Fig. 2에서 나타난 바와 같이 B와 L 라인 모두 종모양에 가까운 모습을 확인할 수 있다. 지나치게 단색인 개체와 깃털색이 두개의 분리된 색을 가진 표현형의 개체수는 적었으며, 상대적으로 적당하게 두 개의 깃털색상이 섞여 있는 개체수가 많았다.

Fig. 2. The distributions of average and standard deviation of RGB values using F₂ individual in line B (A)∼(F). (A)∼(C) Histogram for means and their distribution of R, G and B values respectively. (D)∼(F) Histogram for standard deviation and their distribution of each R, G and B values respectively. The distributions of average and standard deviation of RGB values using F₂ individual in line L (G)∼(L). (G)∼(I) Histogram for means and their distribution of R, G and B values respectively. (J)∼(L) Histogram for standard deviation and their distribution of R, G and B values respectively.

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두 라인의 분포의 차이를 확인하기 위해 라인 별로 t-test를 수행하였다. t-test를 수행한 결과, B, L 라인간의 RGB 평균값 모두에 대해서 모두 유의적인 결과를 확인하였다(p-value<0.01)(Table 1).

두 라인간에 유의한 차이를 숫자로 확인하기 위해 k-means clustering을 기반으로 이미지 양자화를 진행하였다. B와 L라인 각각 전체의 픽셀을 추출해 똑같이 k값을 2로 두고 k-means clustering을 실시하여 파이 차트로 나타낸 결과는 Fig. 3과 같다. B라인의 2가지 대표 색상의 RGB 값은 (143, 148, 122), (36, 37, 31)로 확인되었으며 RGB 값이 높은 것을 밝은 부분, RGB 값이 낮은 것을 어두운 부분이라고 표현하였으며 그 비율은 각각 71%, 29% 이었다. L 라인의 대표 RGB 값은 밝은 부분이 (132, 136, 117), 어두운 부분이 (24, 25, 21)로 나뉘었고, 비율은 각각 70%, 30%로 확인되었다.

Fig. 3. Image quantization results for B (A) and L (B) lines using k=2. The RGB values of the two representative colors of B Line are (143, 148, 122), (36, 37, 31), and their ratios are 71% and 29%, respectively. The RGB values of the two representative colors of L line is (132, 136, 117), (24, 25, 21), respectively, and their ratios are 70% and 30%, respectively.

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두 라인 간의 이미지 양자화를 위하여 k = 2로 설정을 하였으나 k = 2가 맞는 결과를 도출하는지 확인하기 위하여 k = 3를 이용하여 이미지 양자화를 진행하였다. 이미지 양자화를 통해 나타난 닭의 이미지는 Fig. 4에 제시된 바와 같으며 라인 내에서 이미지를 이용하여 파이 차트를 나타낸 결과는 Fig. 5에 나타난 바와 같다. 색 분포의 비율은 B라인에서 밝은 순서대로 37.5%, 38.5%, 24%가 확인되었고, 각각의 대표 RGB 값은 (163, 168, 144), (115, 117, 93), (26, 27, 24)로 확인되었다. 마찬가지로 L라인은 33.8%, 39.5%, 26.7%가 확인되었고, 각각의 대표 RGB 값은 (155, 160, 141), (108, 111, 91), (18, 18, 17)가 도출되었다. 이 경우 RGB 값이 모두 100 이상이면, 밝은 색이라고 할 수 있다.

Fig. 4. The example of image quantization results using k=2 and k=3 in B line. The original picture of an F₂ bird (A), the image quantization result using k=2 (B), the image quantization result using k=3 (C).

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Fig. 5. Image quantization results for B (A) and L (B) lines using k=3. The RGB values of the three representative colors of Line B are (163, 168, 144), (115, 117, 93), (26, 27, 24), and their ratios are 37.5%, 38.5%, and 24%, respectively. The RGB values of the three representative colors of Line L are (155, 160, 141), (108, 111, 91), (18, 18, 17), and their ratios are 33.8%, 39.5%, and 26.7%, respectively.

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k가 2일 때와 마찬가지로 k가 3일 때, B라인이 L라인에 비하여 조금 더 밝았고, 두 분석결과 모두 나뉘어진 색상 밝기의 차이는 분명했다. 밝은 색을 가진 분포들(대표 RGB 색상 값이 100 이상)에서 각각 (8, 8, 3), (7, 6, 2)의 차이가 확인되었고, 어두운 것에서 (8, 9, 7)의 차이가 확인되었다(Fig. 5). 두 라인을 밝은 부분과 어두운 부분으로 나뉘었을 때, B 라인은 76%와 24%로 나뉘었고 L라인은 73.3%와 26.7%로 나뉘었다. 즉 k를 3으로 하였을 때 또한 분포는 비슷하게 나왔지만, B와 L라인 3가지 각각의 대표색상에 대해서 B라인의 RGB 값이 L라인의 RGB 값보다 약 10정도 밝은 수치를 보였다.

본 연구에서 이용된 상호 교배 집단, B와 L 라인이 밝은 부분과 검은색 부분의 비율이 7:3인 것을 확인할 수 있었다(Fig. 3). 닭은 8,000여년 전에 인간에 의해 길들여 졌다고 알려져 있으며(Fumihito et al., 1996), 화이트 레그혼(WL)은 지난 100년간 계란 생산을 위한 산란계로 개량되어 왔다. 이 과정에서 야계(wild jungle fowl)와 WL 사이에 많은 차이가 생겼으며 WL은 야생 닭과 비교하여, 특히 계란의 생산이라는 측면에서 야계에 비하여 월등히 높은 성적을 나타내었다(Kerje et al., 2003; Kerje et al., 2004). WL은 대표적인 산란계로서 고정된 상태로 선발되어 한국에 기원한 오계보다 유전적 다양성이 적고, 산란관련 경제형질과 연관된 유전자형을 많이 가지고 있기 때문이라고 추측할 수 있다.

k = 3으로 나타낸 이미지 양자화 결과에서도 Fig. 3의 B, L라인의 분포와 크게 다르지 않은 것을 확인하였다(Fig. 5). 그리고 k = 3에서 나뉘어진 세 부분을 하얀색, 회색, 검은색으로 나눌 때, 이는 기존 연구에서 검은 피모색 멧돼지와 하얀 피모색을 가진 랜드레이스 사이에서 나온 F₂세대의 표현형의 결과와 유사하였다(Hirooka et al., 2002). 색상 표현형을 두개로 단순화하는 것이, 하나의 표현형을 다른 여러 표현형과 비교하는 것보다 쉬운 것으로 알려져 있다(Visscher et al., 1996). 만약 백색인 표현형을 예로 들어, 백색인 표현형과 비 백색인 표현형들을 비교하는 것이 백색인 표현형과 검은색 표현형을 비교하는 것보다, 어느 색이 영향을 받는 표현형인지 결정하기 어렵기 때문이다.

Fig 2에서 확인할 수 있듯이 B라인의 밝은 부분인 (143, 148, 122)과, L라인의 밝은 부분인 (132, 136, 117) 간의 RGB 색상 값의 차이가 (11, 10, 5)이다. 그리고 B라인의 어두운 부분인 (36, 37, 31)과 L라인의 어두운 부분인 (24, 25, 21)이 (12, 12, 10)의 차이를 보였다. 두 라인간의 분포는 비슷하지만, 평균 RGB 값은 차이가 났기 때문에 Table 1의 t-test에서 유의한 차이를 보인 것으로 확인되었다.

기존 연구에서 밝은 깃털색 암컷과 어두운 깃털색 수컷의 교배, 밝은 깃털색 수컷과 어두운 깃털색 암컷의 교배에서 유전되는 색은 모두 정규화를 나타내었지만, 밝은 깃털 색의 암컷은 어두운 깃털색 수컷의 교배가 그 반대일 때보다 자손 세대에서 밝은 표현형이 더 많이 유전되었다고 하였다(Dobson et al., 2019). 이는 F₁ 세대의 결과이고 야생 개체이기에 지역 간의 차이도 존재할 것으로 판단되나, 어미가 밝은 깃털색인 WL인 본 논문의 결과와 유사하였다. 이 결과를 통해 부계의 표현형보다 모계의 표현형이 자손세대에 더 많은 영향을 미쳤다는 사실을 알 수 있다. 또한, 표현형의 색의 정도를 수치화하여 원인 유전자를 찾을 수 있는 가능성을 제시하고 있다.

K-means clustering(MacQueen, 1967)이 발표된 이래로 머신 러닝 및 데이터 마이닝 분야에서 다각도로 활용되고 있다. 그 중 k-means clustering에 알려진 오랜 문제 중, 임의로 정해야 하는 k값이 있다. 본 논문에서는 F₀의 교배에 사용된 개체의 특징에 따라 2로 나누었지만, F₂ 개체에서 중간 색상의 개체가 나왔을 때 분류가 쉽지 않은 결과도 얻을 수 있었다. 본 연구에서 YO와 WL을 교배했을 때, 밝은 개체와 어두운 개체만 나오는 것이 아니라 육안으로 확인하기에 갈색인 개체도 있었고, 노란색 깃털색을 가진 개체도 존재했다. 하지만 본 연구에서는 YO와 WL의 특징만을 추출하고 분류하기 위해서 k = 2로 설정하여, 앞에서 기술한 이상 깃털색의 개체를 고려하지 않아 앞으로 추가 연구가 필요할 것으로 판단된다.

K-means clustering의 결과 분포가 7:3이고 대표 RGB 색상이 계산되었다고, 그 그룹을 전부 설명할 수 있는 것은 아니라고 생각한다. 개체에 모든 픽셀의 RGB 평균값에 K-means clustering을 사용했다는 점에서 지나친 일반화의 가능성이 존재한다. 극단적으로 예를 들어, 실험군에 비교될 B와 L라인이 4마리라고 가정하였다. 그 때, 개체 중 RGB 픽셀값이 (100, 100, 100)인 개체와 (0, 0, 0)인 개체가 섞인 분포와, (100, 100, 100) 값의 픽셀과 (0, 0, 0) 값의 픽셀이 50:50으로 혼합되어 있는 개체의 RGB 값의 분포가 같을 수 있기 때문이다.

닭에서 흔히 발견되는 깃털 패턴 중 하나로 횡반이 있다. 횡반 유전인자는 횡반이 아닌 것에 대해 우성이라 반성유전을 한다고 알려져 있다(Oh, 1972). 또한, 본 실험에서 규정한 점박이(spotted) 패턴은 어느 한 영역에 비슷한 값의 RGB가 분포되어 있을 때, 그 주변과 다른 RGB 값의 이상치들은 하나의 속성값으로 계산이 된다(Wandell, 1993). 이런 이유로 표준편차로는 점박이와 횡반 개체를 구분할 수 없다. 추후 연구에서는 점박이와 횡반을 육안으로 분류하고 실험을 진행할 필요가 있다.