토종실용닭의 암수 간 산육 능력 및 스트레스 반응 정도 비교

시험계의 생존율은 1일령부터 12주간 육성 전기(0~8주)와 후기(8~12주)로 나누어 조사하였다. 생존율의 분석은 암컷과 수컷 각 입식 수 대비 생존 수수에 대한 백분율로 나타내었다.

체중의 측정은 공시한 암수 전 개체를 대상으로 1일령부터 12주령까지 2주 간격으로 측정하였다.

개체별 사료 섭취량은 암수별 및 반복별 주간 총섭취량을 조사하였고, 사료요구율은 반복별 전체 사료 섭취량을 해당 구의 증체량으로 나눈 중량비로 나타내었다.

텔로미어 함량 분석은 2주령 및 12주령에 공시된 개체 중 수컷 121수와 암컷 131수의 익 정맥에서 채혈한 혈액으로부터 백혈구를 분리하여 이용하였다. 닭의 백혈구 세포에 대한 텔로미어 분석은 형광접합보인법(Fluorescence in situ Hybridization)을 이용하여 Cho et al.(2022)이 제시한 방법으로 시행하였다. 표본 슬라이드는 RNase(Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN, USA)로 처리한 후 hybridization 용액(13 μL formamide, 5 μL hybridization buffer)과 200 ng의 telomeric DNA probe를 혼합하여 85°C에서 5분간 변성시키고, 38°C에서 12시간 이상 접합하였다. 이후 72°C의 2×SSC 용액과 PN buffer(0.1% sodium phosphate, 0.1% Nonidet P-40)로 세척하고 anti-digoxigenin-fluorescein(Boehringer Mannheim)으로 형광 접합한 다음 propidium iodide solution(Sigma Chem)으로 염색하였다. 과정을 마친 표본은 형광현미경(Model AX-70, Olympus, Tokyo, Japan)으로 관찰한 후 개체 별 100개 이상의 핵을 디지털카메라(Model DP-70, Olympus, Tokyo, Japan)로 촬영하였다. 촬영한 상은 이미지 분석프로그램(MetaMorph^®, UIC, Pennsylvania, USA)을 이용하여 telomeric DNA의 상대적 함량을 분석하였다.

세포 내 DNA 손상률의 분석은 Comet assay 방법으로 Cho et al.(2016)이 시행한 방법에 따라 실시하였다. 표본은 12주령 암수 각 73수의 혈액으로부터 백혈구만을 분리하여 제작하였다. 제작한 표본에 0.5% low melting point agarose(LMPA)를 도포하고 냉장 상태로 굳힌 다음 다시 1% LMPA에 침지하였다. 이후 4°C lysis solution(2.5 M NaCl, 100 mM disodium EDTA, 10 mM Trizma base)으로 60분간 처리한 다음 25 V, 300 mA로 30분간 전기영동 하였다. 처리를 마친 슬라이드는 neutralization buffer(0.4 M Tris-HCl)로 세척한 후 70% 에탄올로 탈수하였다. 건조된 슬라이드는 propidium iodide solution(Sigma Chem)으로 염색하고 형광현미경으로 관찰하였다. 개체별 50개의 세포를 대상으로 Comet Score software 1.5(TriTek Corp. Sumerduck, VA, USA)를 이용하여 tail내 DNA 함유율(% DNA in tail), tail 내 DNA 생성률(tail moment) 및 올리브 모먼트(olive moment)를 분석하였다.

개체의 heterophil-lymphocyte의 비율(H/L ratio) 측정은 comet assay에 이용한 표본과 같은 시료로서 Jeong et al.(2020)이 제시 방법과 동일하게 분석하였다. 제작된 백혈구 표본은 25% Giemsa stain solution(Sigma Chem., St Louis, MO, USA)으로 염색한 후 광학현미경(Model BX-50, Olympus, Tokyo, Japan, obj. x40)으로 관찰하고 무작위로 30개의 관측 상을 선정한 후 단위 면적당 heterophil과 lymphocyte 수를 측정하였다.

HSP 유전자 발현율 분석을 위해 12주령 수컷 69수와 암컷 73수의 혈액으로부터 RNA를 추출한 후 cDNA를 합성하였다. HSP 분석은 HSP-70, HSP-90α 및 HSP-90β 유전자를 대상으로 하여 Q-PCR 방법으로 mRNA의 발현율을 조사하였다. 본 분석에 사용한 primers와 Real-time PCR의 방법은 Cho et al.(2016)이 시행한 방법과 동일하게 실시하였다. HSP의 Tm값은 LightCycler^® 480 software v1.5(Roche Diagnostics, GmbH, Mannheim, Germany)를 이용하여 분석하고 각 유전자의 상대적 정량 값은 Livak and Schmittgen(2001)이 제시한 2^−ΔΔCt방법으로 분석하였다.

토종실용닭의 암수 간 체중과 성장 양상을 Table 1과 Fig. 1에 제시하였다. 분석 결과, 발생시 체중을 제외한 모든 주령에서 암수 간 유의한 체중의 차이를 보이며(P<0.01) 전 기간 수컷이 암컷보다 높은 체중을 나타내었다. 암수 간 체중의 편차는 성장이 진행되면서 점진적으로 커지는데 2주령 때 암컷 대비 수컷의 체중이 106%에 불과하던 것이 12주령 때는 121%로 증가하면서 암수 간 체중의 차이가 급격히 증가하는 것으로 나타났다. 토종닭의 암수 간 성장 양상은 많은 연구에서 본 결과와 거의 같은 양상을 보고하고 있는데(Ogola et al., 2021; Sohn et al., 2021a) 특히 신품종 토종닭 생산을 위한 교배조합 검정 시험에서 모든 조합의 토종닭이 주령이 증가함에 따라 암수 간 체중의 차이가 벌어지면서 10주령 체중에서 수컷은 2,334 g, 암컷은 1,876 g으로 암수 간에 458 g의 차이를 보인다고 하였다(Sohn et al., 2021b). 이처럼 출하 시점에서 토종실용닭의 암수 간 큰 체중의 편차는 상품 균일성 저하의 주된 원인이 되고 있다. 따라서 토종실용닭의 경우 체중의 균일도 및 상품의 균일성을 높이기 위해서는 반드시 암수 분리 사육이 필요하다고 사료된다.

Fig. 1. Growth curve of male and female Korean native commercial chickens.

Download Original Figure

토종실용닭 암컷과 수컷의 주령별 수당 1일 평균 사료 섭취량 및 사료요구율을 Table 2에 제시하였다. 분석 결과, 암수 간 주령별 수당 사료 섭취량은 전 사육 기간 모두 유의한 차이가 있는 것으로 나타났고(P<0.01), 사료요구율은 4주령까지 누적 사료요구율을 제외한 모든 기간에서 유의한 차이를 보였다(P<0.05). 12주간 수당 1일 평균 사료 섭취량은 수컷이 93.6 g, 암컷은 82.4 g으로 수컷이 암컷보다 평균 10 g 이상의 사료를 더 섭취하였고, 누적 사료요구율은 수컷이 2.76, 암컷은 2.97로 암컷이 수컷보다 0.2 정도 높은 것으로 나타났다. 이러한 결과는 브로일러 및 토종닭의 사육 형태에 따른 시험에서도 비슷한 결과를 보이는데 수컷 분리 사육 구가 훨씬 많은 사료를 섭취하고 높은 사료 이용성을 보인 반면 암컷 분리 사육 구는 수컷보다 적은 사료를 섭취하고 낮은 사료 이용성을 보였다고 하였다(Da Costa et al., 2017; Ogola et al., 2021; Sohn et al., 2021a).

이상 산육 능력에 대한 분석 결과를 종합할 때, 토종실용닭 암수 간 체중 및 사료 이용성의 차이가 명확하게 존재함으로 상품의 균일도 및 사양관리의 효율성을 제고할 때 암컷과 수컷을 분리 사육하는 것이 토종실용닭의 생산성 향상을 위한 바람직한 사육 방법으로 사료된다.

입식 이후 12주령까지 토종실용닭의 암수 간 생존율을 육성 전기와 후기로 나누어 조사하고 이의 결과를 Fig. 2에 제시하였다. 분석 결과, 12주령까지 전 기간 수컷의 생존율은 73.8%, 암컷은 82.8%로 암수 간에 유의한 차이를 보였다(P<0.05). 특히 육성 후기에 암수 간 생존율의 차이가 두드러지게 나타나는데 이는 수컷 간 싸움으로 인한 폐사수의 증가가 수컷 생존율에 크게 영향을 미친 것으로 보인다. 이러한 결과는 브로일러의 암수 간 생존율과 면역 반응 비교 시험에서 2주령 이후부터 출하일령까지 수컷 폐사율이 암컷보다 유의하게 높았고, 암컷의 면역 반응이 수컷보다 훨씬 높게 나타났다는 보고와 잘 일치되는 결과이다(Leitner et al., 1989; Yerpes et al., 2020). 그러나 일부 브로일러 사육 시험에서 수컷과 암컷 간 폐사율의 차이는 없다는 보고(Beg et al., 2016)와 토종닭의 암수 분리 사육 시험에서 12주령까지 수컷의 생존율은 96.9%, 암컷의 생존율은 98.8%로서 이들 간의 차이가 유의하지 않다라는 결과(Sohn et al., 2021a)와는 다소 차이가 있다. 닭의 생존율은 주로 사육 환경적 요인에 의해 크게 영향을 받지만, 품종이나 계통에 따른 유전적 요인에 의한 영향도 있고(Kim et al., 2019; Cho et al., 2020; Sohn et al., 2021b) 성별에 따른 생리적 차이도 영향을 미치는 것으로 판단된다.

Fig. 2. Survival rates of male and female Korean native commercial chickens. The different letters of superscript within the column significantly differ (P<0.05).

Download Original Figure

토종실용닭 암컷과 수컷의 생리활성도 및 스트레스 반응 정도를 비교하고자 telomeric DNA의 상대적 함량 값을 분석하였다. 공시된 암수 개체들에 대한 2주령 및 12주령의 텔로미어 함유율과 두 측정 기간 텔로미어의 감축률을 Table 3에 제시하였다. 분석 결과, 암수 공히 연령이 증가함에 따라 텔로미어 함량이 감소하였고 감축의 정도는 12주령 때 2주령 대비 약 14% 정도 감소한 것으로 나타났다. 그러나 2주령과 12주령의 텔로미어 함유율 및 이 기간 감축율 모두 암수 간의 차이는 없는 것으로 나타났다. 텔로미어는 염색체 양 말단부를 지칭하는 것으로 세포 분열 때마다 일정량의 DNA의 소실이 일어나고 이에 따라 대부분의 생물체에서 연령이 증가함에 따라 텔로미어 길이는 감소하게 된다(Harley et al., 1990, 1992). 그러나 텔로미어 길이의 감축 정도는 품종이나 계통과 같은 유전적 요인에 의한 영향뿐만 아니라 사육 조건과 같은 환경적 요인에 의해서도 많은 영향을 받는 것으로 알려져 있다(Sohn and Subramani, 2014; Sohn et al., 2015; Cho et al., 2022). 특히 내외적 스트레스는 텔로미어 길이의 감축을 현격히 촉진함으로 텔로미어 함량이나 감축 정도를 개체의 스트레스 반응 표지로 이용한다(Beloor et al., 2010; Sohn et al., 2012). 따라서 토종실용닭 암수 간의 텔로미어 분석 결과를 바탕으로 성별 간 생리활성도와 스트레스 반응 정도의 차이는 없다고 판단된다.

백혈구 세포 내 DNA 손상 정도를 단일 세포 전기영동 방법인 comet assay로 분석하였다. Comet assay는 세포 내 DNA 손상 정도를 검출할 수 있는 단순한 기술로서 파손된 DNA를 전기영동한 후 이미지를 정량하는 방법인데 형광 염색된 세포 형상이 혜성의 모습을 닮아 붙여진 이름이다(Singh et al., 1988). Comet assay 분석 지표로는 전체 핵 대비 DNA 파손율을 나타내는 % DNA in tail, tail 내 DNA 생성률을 제시하는 tail moment 및 DNA 파손 분포와 정도를 상대적으로 나타내는 Olive moment가 있다(Ryu et al., 1997; Mozaffarieh et al., 2008; Kumaravel et al., 2009). 토종실용닭 암수 간 DNA의 손상 정도를 이들 표지로써 분석하고 이의 결과를 Table 4에 제시하였다. 분석 결과, 암수 간 모든 표지에서 차이가 없는 것으로 나타나 암컷과 수컷 간의 DNA 손상 정도는 같다고 판단된다. 생명체의 내외적 스트레스는 세포의 사멸 및 DNA 손상을 촉진한다고 알려져 있다(Chen et al., 2007). 특히, 닭에 있어 산화 스트레스가 DNA 손상률을 가속한다고 보고한 이래 가금에서 스트레스 반응 척도를 가늠하는 표지로 유용하게 활용되고 있다(Faullimel et al., 2005; Sohn et al., 2012). 닭의 DNA 손상 정도는 암수 혼합 사육한 개체들이 분리 사육한 개체보다 높고(Jeong et al., 2020), 케이지 사육 개체가 평사 사육 개체보다 높다고 하여(Choi et al., 2020) 스트레스 적 환경이 DNA 손상을 촉진함과 더불어 동일 사양 조건에서 품종 간의 차이도 있다고 하였다(Sohn et al., 2014; Cho et al., 2016). 그러나 본 연구 결과, 토종실용닭 암컷과 수컷 간의 DNA 손상 정도는 차이가 없는 것으로 나타나 암수 간의 스트레스 반응 정도는 비슷하다고 판단된다.

실용토종닭 암수 간의 스트레스 반응 정도를 비교하기 위하여 혈액 내 H/L ratio를 분석하고 이의 결과를 Table 4에 제시하였다. 분석 결과, 암수 간의 H/L ratio 값은 거의 비슷한 수치로서 이들 간의 차이는 없는 것으로 나타났다. H/L ratio는 스트레스 반응 표지 중 하나로 혈액 내 heterophil과 lymphocyte의 비율을 나타내는 것으로 스트레스가 증가할수록 혈액 내 heterophil의 수는 증가하고 lymphocyte의 수는 감소한다(Gross and Siegel, 1983; Gross, 1989; McFarlane and Curtis, 1989). 닭의 경우 고온이나 밀사와 같은 스트레스 적 환경에서 사육된 개체들의 H/L ratio 값이 증가하였고(Campo et al, 2007; Cotter, 2015), 암수 혼합 사육이나 케이지 사육과 같은 스트레스 적 요인도 H/L ratio를 증가시킨다고 하였다(Choi et al., 2020; Jeong et al., 2020). 반면 동일 사양 조건에서 품종 간 H/L ratio 값의 차이도 보고하고 있는데 Cornish 종이 Rhode 종보다 월등히 높은 H/L ratio 값을 보인다고 하였다(Cho et al., 2020). 그러나 토종실용닭의 암수 간 H/L ratio 분석에서 성별에 따른 차이는 없는 것으로 나타나 이들 간 스트레스 반응 정도의 차이는 없는 것으로 사료된다.

토종실용닭 암수 간의 스트레스 반응 정도를 살펴보고자 HSP-70, HSP-90α 및 HSP-90β 유전자 발현율을 분석하고, 이의 결과를 Fig. 3에 제시하였다. 분석 결과, HSP-70 유전자 발현율을 제외하고 암수 간의 HSP 유전자 발현율 차이는 없는 것으로 나타났다. HSP-70 유전자 발현율은 암컷이 수컷보다 1.5배 정도 높게 나타났으나 HSP-90α와 HSP-90β 유전자 발현율은 암수 간 유의적 차이가 없는 것으로 분석되었다. HSP는 열 반응 합성 단백질 군으로 개체들이 고온 스트레스에 노출되면 이의 발현율이 증가한다고 알려져 있다(Lindquist, 1986; Schlesinger, 1986). 닭에 있어서도 스트레스 반응 표지로 HSP가 유용하게 사용되는데 열 스트레스뿐만 아니라 외부 스트레스 적 환경에 노출되었을 때도 HSP의 발현율은 상승한다고 하였다(Zulkifli et al., 2002; Beloor et al., 2010; Sohn et al., 2012). HSP의 발현율 정도는 환경적 요인뿐만 아니라 유전적 요인에 의해서도 영향을 받는 것으로 알려져 있는데 닭의 품종 및 계통 간에도 이들의 차이가 있는 것으로 보고하고 있다. 국내 토종닭 품종들에 대한 HSP 발현율 분석 결과 토착코니시 종의 발현율이 가장 높았고, 재래황갈 종 및 토착로드 종의 발현율이 상대적으로 낮았다고 하였고(Sohn et al., 2015; Cho et al., 2020) 토종닭 교배조합 시험에서 경량 종 계통의 교잡계가 고체중 계통의 교잡계보다 발현율이 낮다고 하였다(Cho et al., 2016). 그러나 본 시험에서 암수 간 HSP 발현율의 차이는 없는 것으로 나타나 본 발현율에 따른 토종실용닭 암수 간 스트레스 반응 정도의 차이는 없는 것으로 사료된다. 이상 토종실용닭의 암수 간 생존율 및 텔로미어 함유율, 세포 내 DNA 손상률, H/L ratio, HSP 유전자 발현율을 비교·분석한 결과, 암컷이 수컷보다 생존율은 높으나 스트레스 지표 간의 차이는 없는 것으로 나타나 이들 간 스트레스 반응 정도의 차이는 없는 것으로 사료된다.

Fig. 3. Comparison of HSP gene expression levels between male and female Korean native commercial chickens. The expression values are 2^−ΔΔct which indicate the fold change in gene expression relative to the control. A superscript of an asterisk (*) within a column indicates a significant difference (P<0.05).

Download Original Figure